| 애기장대에서 활성 표지 선별법 (Activation Tagging Screen in Arabidopsis thaliana) 안 지 훈 / 박사 고려대학교 BK21 생명공학원 조교수 Tel. 02-3290-3451 Fax. 02-927-9028 E-mail. jahn@korea.ac.kr 최근들어 특정 유전자의 기능을 알아보기 위해서 특정 유전자의 기능을 없앤 기능 손실 돌연변이체 (loss-of-function mutant)를 이용한 유전학적, 분자생물학적 방법이 널리 사용되고 있다. 이 기능 손실 돌연변이체를 사용한 연구가 각광을 받는 이유는 어떤 유전자의 기능을 손상시킨 후에 일어나는 형질의 변화는 그 유전자의 기능을 추정하는데 가장 직접적인 증거를 제공하기 때문이다. 이미 오래전부터 사용되었던 상동 재조합 (homologous recombination) 방법을 이용한 knock-out 쥐의 제조도 유전자의 기능을 알아보기 위해 수행했던 방법의 대표적인 본보기이다. 그러나 식물에서는 이러한 상동 재조합을 수행하기 매우 어렵고 그 효율도 극히 낮기 때문에 (13), 식물분자생물학의 모델식물로 사용되는 애기장대 (Arabidopsis thaliana)의 경우 기능 손실 돌연변이체를 제조하기 위해서는 EMS (ethyl methanesulfonate)와 같은 화학물질을 이용하거나, 감마선 조사와 같은 물리적인 방법을 이용하거나, 혹은 T-DNA 표지 (T-DNA tagging)와 같은 생물학적인 방법을 이용하고 있다. 그러나 이러한 기능 손실 돌연변이체를 제조하여 특정 유전자의 기능을 연구하는 것은 여러가지 장점에도 불구하고 기능손실 돌연변이체만 통해서는 해당 유전자의 기능을 알아내기 어려운 경우가 존재한다. 그러한 예는 다음과 같다. (1) 첫번째로는 어떤 유전자의 기능이 다른 유전자의 기능과 중복되는 경우이다 (functional redundancy). 즉, 그 유전자 이외에도 유사한 역할을 하는 유전자가 존재하여 한 유전자의 기능 상실만으로는 돌연변이체가 형질을 보이지 않는 경우이다. 이 문제는 최근 몇년동안 여러 진핵생물의 게놈 염기서열이 밝혀짐으로써 그 문제가 더욱 두드러지게 부각되었다 (1, 20). 염기서열 결정 결과 게놈안에는 서로 높은 상동성을 갖는 유전자들이 많이 존재하는 것이 밝혀졌으며, 이들은 단백질 비암호화 부위에서도 높은 상동성을 보이는 경우도 있어서 이들 가운데 대부분은 세포내의 기능이 중복될 것으로 보인다. 실제로 이러한 유전자의 기능적 중복의 예는 흔하게 발견된다. 예를 들어 쥐의 근육세포 발달에서 MyoD나 Myf-5 둘 중에 하나의 유전자를 전위 과량 발현 (ectopic overexpression) 시키면 섬유아세포에서 근육섬유로의 분화를 야기하는데 충분하지만 MyoD혹은 Myf-5 유전자 각각의 기능 손실 돌연변이체로는 근육분화는 대부분 정상적으로 일어난다. 오로지 두 유전자가 동시에 돌연변이가 일어났을때만 근육분화가 일어나지 않는 것을 볼 수 있다 (19). 애기장대에서도 위와 같은 예를 발견할 수 있다. 에틸렌 반응경로에 관여하는 히스티딘 키나제 중의 일부를 돌연변이시켜도 특별한 형질을 볼 수 없고 모든 히스티딘 키나제를 불활성화시켜야만 에틸렌에 대한 반응이 항상 활성화된 형질이 나타난다 (10). 그러나 이들 키나제 가운데 어느 하나만 과량발현시켜도 그 반대의 표현형을 보이는데 충분하다. 이러한 사실들로 볼때 게놈상에서 발견되는 높은 상동성을 보이는 유전자군들은 아마도 기능이 중복되는 것으로 보이며, 따라서 한 유전자의 돌연변이만으로는 표현형을 찾기 어렵게 된다. (2) 두번째 경우는 배발생 초기에 발현하여 만약 그 유전자의 기능이 손실되었을때 생물체의 발생이 전혀 이루어지지 않게 되는 유전자들의 경우이다. 이러한 경우 해당 유전자의 기능 손실 돌연변이체 제조를 시도하면 그 생물은 초기 배발달이 이루어지지 않게 되므로 해당 유전자의 돌연변이체를 전혀 얻을 수 없게 된다. 따라서 기능손실을 야기하는 일반적인 선별 방법으로는 이러한 유전자를 분리하기란 매우 어렵다. 이렇게 초기 배발생에 관여하는 유전자의 예로는 초파리의 형태 형성에 관여하는 Antp 유전자를 들 수 있다. 이 유전자의 정상적인 기능은 흉부에서 다리의 형성을 촉진하지만 이 유전자가 불활성화되면 배발생이 이루어지지 못한다 (7). 즉 이 유전자에 돌연변이가 일어나면 초파리의 초기 배발생이 일어나지 않아서 기능 손실 돌연변이체를 얻을 수 없지만 이 유전자를 과량 발현시키면 초기발생은 정상적으로 일어나는 대신 안테나가 다리로 변하는 돌연변이가 일어나 기능 획득 돌연변이체는 얻을 수 있다. 이러한 이유로 기존의 기능손실 돌연변이체 선별 방법은 그 막강한 장점에도 불구하고 제한적으로 사용될 수 밖에 없다. 그런데 식물 분자생물학의 모델 식물인 애기장대에서 기능 손실 돌연변이체 선별 방법의 대안으로서 기능 획득 돌연변이체 선별 방법이 확립되었고 널리 쓰이고 있기에 이에 소개하고자 한다. 활성 표지 선별법 (Activation tagging screen) 이 활성 표지 선별 방법은 Cauliflower 모자익 바이러스의 35S 프로모터 enhancer 서열이 비교적 멀리 떨어져 있는 상태에서도 주변의 유전자의 전사를 활성화 (transcription activation) 시킬 수 있다는 점을 이용하여 기능 획득 돌연변이체를 얻는 방법이다. 먼저 이 enhancer 서열을 애기장대 게놈에 무작위로 도입시킨 후 주위의 유전자의 전사를 활성화시키고 (Figure 1), 그 후 기능 획득 표현형을 보이는 식물체를 선별하고 게놈 DNA를 회수하여 전사 활성화된 유전자를 클로닝하는 방법이다. 식물에서 이 35S 프로모터의 enhancer를 이용한 시도는 90년대 초에 처음 제한적으로 시도되었다. 1992년 독일 막스플랑크의 Walden 박사 연구팀은 이 enhancer 서열을 이용하여 인근 유전자의 발현정도를 증가시킴으로써 식물 호르몬인 오옥신 (auxin)에 비의존적으로 성장하는 기능 획득 돌연변이체를 얻어내고 이 방법을 활성 표지 (activation tagging)라고 이름지었다 (9). 이 선별 방법으로 Kakimoto는 애기장대의 조직 배양 시에 시토키닌이 필요하지 않는 돌연변이체를 분리하고 그 형질은 히스티딘 키나제에 의해 매개됨을 보고한 적도 있다 (11). 이 초기 단계의 활성 표지법이 이용될 당시에는 식물 형질전환을 위해 조직배양을 이용하였고, 얻을 수 있는 형질전환체와 분리할 수 있는 유전자의 수도 극히 제한되어 있었다. 그러나, 최근에 애기장대에서 조직배양을 통하지 않고 쉽게 형질전환체를 얻을 수 있는 in planta 형질전환 방법이 개발되고 그 효율이 기능체 유전학 (functional genomics)에 사용할 수 있을 정도로 매우 높아지면서 (3, 6, 5), 이 활성 표지 선별 방법을 전체 게놈을 대상으로 실시할 수 있게 되어 기능이 밝혀지지 않았던 유전자를 쉽게 분리할 수 있게 되었다 (23). 활성 표지 벡터 현재 널리 사용되고 있는 활성 표지 벡터는 SKI015, SKI074 두 종류이다. 이들의 기본 구성은 모두 같으며 형질전환체를 선별하기 위해 사용되는 저항성 유전자만 다르다. 이들 벡터의 중요 구성은 다음과 같다 (Figure 2). (1) 형질전환체를 선별하기 위한 저항성 유전자. SKI015는 제초제인 Basta (=ammonium glufosinate) 저항성 유전자를 지니고 있고, SKI074는 카나마이신 저항성 유전자를 지니고 있다. Walden 연구팀에 의해 개발된 원래의 활성 표지 벡터인 pPCVICEn4HPT는 하이그로마이신 (hygromycin) 저항성 유전자를 지니고 있으나 (9), 이 항생제를 사용해서는 애기장대에서 형질전환체 선별이 어렵고 또한 사람에게 유해하기 때문에 Basta 저항성 유전자와 카나마이신 저항성 유전자로 교체되었다. (2) 35S 프로모터로부터 유래한 enhancer 서열 4개 (16). 전술한 바와 같이 이 enhancer 서열은 인접한 유전자의 전사를 활성화시키는 역할을 담당한다. (3) PUC19 벡터. 이는 enhancer 주변의게놈 DNA 절편을 클로닝할 수 있도록 해주며 플라스미드 회수된 재조합 플라스미드가 E. coli안에서 복제, 증식가능하게 해주는 역할을 담당한다. (4) 복제에 필요한 DNA 염기서열. Agrobacterium과 식물체에서 DNA를 복제할 수 있는 염기서열을 간직하고 있다. 실제 사용방법 활성 표지 벡터를 식물체에 무작위로 도입시키고 T1 세대의 식물체를 많이 얻어낸 후 실험 목적에 따라 적절한 우성 표현형을 보이는 식물체를 선별한다. 실제로 형태적으로 뚜렷한 우성 표현형체를 분리할 수 있는 확률은 약 1/1000 정도 된다는 보고가 있었으므로 (24), 많은 수의 T1 형질전환체를 만들수록 우성 표현형 식물체를 발견할 확률은 높아진다. 우성 표현형을 보이는 식물체를 확인하였으면 식물체를 자가 교배시킨 후 T2 세대 종자를 얻어낸 다음, 사용했던 벡터가 간직하고 있는 저항성 유전자를 이용하여 T-DNA가 들어있는 식물체만 고른다. T1 세대의 형질전환 식물체당 1카피 이상의 T-DNA가 들어가는 경우도 많이 발생하므로, 실제 T2 세대의 선별 배지에서 형질전환체와 비형질전환체로 나뉘어지는 유전자형의 분리 (segregation)가 3:1로 나뉘지 않는 경우도 생긴다. 이렇게 하나 이상의 T-DNA가 게놈에 삽입되는 경우는 형질전환에 사용했던 식물체와 역교배 (back cross)함으로써 하나의T-DNA만 삽입되어 있는 형질전환체를 분리해낼 수 있다. T2 세대에서 유전자형의 분리가 3:1로 나뉘어지면 T1 세대에서 보여졌던 형질이 우성으로 분리되는지 열성으로 분리되었는지 확인한다. 매우 드문 경우이지만 만약 표현형이 열성으로 분리되면 이것은 어떤 유전자의 활성으로 얻어진 우성 표현형 (dominant phenotype)이 아니라 T-DNA 삽입으로 인한 표지 (insertional T-DNA tagging)일 가능성이 높다. 플라스미드 회수 (plasmid rescue) 형질전환체에서 식물체의 표현형이 우성으로 판단되면 전사활성을 보이는 enhancer 주위의 게놈 DNA를 분리하고자 플라스미드 회수를 실시한다. 형질전환 식물체의 게놈 DNA를 순수분리하고 여러 제한효소로 절단한 다음 T4 DNA 리가제를 첨가하여 ligation시키고 E. coli 세포에 도입시킨다. 회수된 게놈 DNA의 염기서열을 결정하여 애기장대의 게놈 어느 지역으로 T-DNA가 삽입되었는지 조사한다. 지금까지 수행되었던 실제 활성 표지 선별 결과에 의하면 이 플라스미드 회수에 의해서 수백 bp에서부터 10kb가 넘는 게놈 DNA를 회수할 수 있었고, 많은 경우 이 게놈 DNA는 전사활성이 된 완전한 ORF를 간직하고 있었다. 염기서열 결정에 의해 T-DNA 삽입위치를 결정하였으면 삽입된 T-DNA 주변의 어느 부위가 과량 발현되는지 Northern 혼성화 반응이나, RT-PCR을 사용하여 조사한다. 과량발현되는 DNA 절편을 찾아낸 이후 그 절편내에서 ORF를 발견하게 되면 다음 단계로는 그 유전자의 과량발현이 해당 우성 표현형을 보이는지 확인해야 한다. 표현형 재현 (recapitulation) 회수된 게놈 DNA에 의해서 우성 표현형이 나오는지는 형질 재현 실험을 통하여 확인한다. 형질 재현 실험에 사용하는 방법으로는 크게 세가지 방법이 이용되고 있다. 첫번째는 35S 프로모터 enhancer가 결합된채로 플라스미드 회수에 의해 얻어진 게놈 DNA를 다시 식물체에 도입한 후 해당 우성 표현형이 재현되는지를 보는 방법이다. 이 방법은 표현형과 회수된 게놈 DNA와의 연관성을 가장 직접적으로 증명할 수 있지만 게놈내에서 전사활성된 유전자의 일부분만 플라스미드 회수에의해 분리되는 경우에는 사용할 수 없다. 이 경우에는 회수된 게놈 DNA 절편을 포함하는 보다 큰 게놈 DNA 절편을 BAC (Bacterial Artificial Chromosome) 클론에서 분리하고 표현형 재현 벡터에 클로닝한 후에 이를 다시 도입하여 그 표현형이 재현되는지 확인한다. 널리 사용되는 발현 재현 벡터로는 pPZP212 (8)를 기본으로 제조된 pMN19과 pMN20가 있다 (Figure 2). 이들 두 벡터의 차이점은 4개의 35S enhancer가 다른 방향으로 배열되어있는 것이며 다른 구성성분은 모두 같다. 세번째 방법은 전사활성이 된 것으로 보이는 유전자의 full-length cDNA를 분리한 다음 이를 35S 프로모터의 조절하에 발현되도록 재조합 플라스미드를 만들고 식물체에 도입시켜 형질이 재현되는지를 조사한다. 여러 이용 사례 이 활성 표지 선별법은 어떤 식물체를 대상으로 선별하는가에 따라 여러 방법으로 응용하여 사용할 수 있다. 예컨데, 야생형 식물에서 특정한 우성 표현형을 보이는 식물체를 선별하여 이 유전자를 클로닝하는 경우를 들 수 있다. 애기장대에서 개화시기조절에 관여하는 FT (Flowering Locus T) 유전자의 클로닝 경우, 야생형 식물에 활성 표지 선별법을 실시하고 개화시기가 빨라지는 식물체를 골라내어 유전자를 분리한 결과 FT 유전자를 클로닝할 수 있었다 (12). 또한 신호전달 경로상에서 특정 유전자의 기능을 하위단계에서 억제하는 유전자 (suppressor)를 찾아내기 위해서도 이 방법은 사용될 수 있다. 예를 들자면 애기장대의 ga1 돌연변이체는 식물 호르몬인 GA의 생합성 경로에 참여하는 유전자의 기능이 손실되어 단일조건에서 개화하지 않는 형질을 보인다. 이것은 애기장대의 단일조건에서의 개화에는 GA가 필수적이기 때문이다. 이 돌연변이 식물체를 대상으로 활성 표지 선별법을 수행하여 GA가 생합성되지 않아도 단일조건에서 개화하는 식물을 찾아내기도 하였다 (Blazquez and Weigel, unpublished). 또한 서울대학교의 이일하 교수 연구팀은 우성인 FRI, FLC를 간직하고 있기 때문에 늦은 개화시기를 보이는 애기장대에서 활성 표지 선별법을 실시하여 빠른 개화시기를 보이는 식물체를 찾아내고 여기서 AGL20 유전자를 클로닝하고 이를 보고한 바 있다 (14). 지금까지 활성 표지 선별법을 이용하여 분리된 유전자의 목록은 표 1과 같으며 점점 더 많은 유전자들이 이 활성 표지법으로 분리되고 발현 특성이 규명되고 있다. 얻어진 우성 표현형의 안정성 활성 표지 선별법으로 얻어진 기능 획득 돌연변이체는 초기 몇세대 동안은 안정적으로 우성 표현형이 유지되는 것으로 알려져 있다. 그 중 일부 (esc-1D, jaw-1D, jaw-2D, pap1-1D)는 최고 8세대까지 안정적으로 그 형질을 유지하였다. 그러나 어떤 돌연변이체들 (ft-9D, top1-1D, gAT10, gAT14)은 다음 세대로 가면서 우성 표현형이 점점 약해지는 양상을 보이기도 했다. 개화시기가 빨라지는 형질을 보이는 ft-9D의 경우 발현 강도가 감쇠되면서 개화시기도 점점 느려져서 결국 야생형 식물의 그것과 같아졌다. 그러나 시간이 지나면서 이 표현형의 감쇠가 계속되면서도 개화시기는 야생형보다 느려지지는 않았는데, 이러한 사실은 표현형의 감쇠는 35S 프로모터 enhancer 에 의한 활성이 점점 불활성화되어 가는 것이며 FT 유전자의 기능이 불활성화되는 것은 아니라는 것을 시사한다. Enhancer 염기서열의 작용 현재까지 보고된 바로는 활성 표지 선별법의 결과에 의하면 enhancer 염기서열은 380bp에서 3.6kb까지 떨어진 주위 유전자를 활성화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다 (22). 그리고 활성화된 유전자는 대부분 enhancer에 바로 근접한 유전자들이었으며 하나 이상의 유전자가 동시에 전사 활성되지는 않았다. 그리고 지금까지 수행된 많은 기능 손실 돌연변이체 선별법에서 보고되었던 것과는 달리 (2), T-DNA에 의한 게놈 DNA의 재배열은 거의 없는 것으로 보였다. 이는 아마도 enhancer와 인접 게놈 DNA와의 특별한 상호작용에 의해 기능 획득 표현형을 보이는 것때문으로 생각되며, 게놈 DNA의 재배열이 일어난다면 그러한 표현형도 관찰할 수 없을 것으로 보인다. 한가지 흥미로운 것은 선별법에서 기능 획득을 가능하게 해주는 35S 프로모터의 enhancer 서열은 아마도 35S 프로모터와는 다른 작용기작을 갖는 것 같다는 사실이다. 이러한 의문은 T-DNA로 충분히 애기장대의 게놈을 포화시킬 정도의 많은 형질전환체를 얻었지만 이미 기존에 클로닝된 유전자의 기능 획득 표현형이 많이 발견되지 않았다는 사실에서 제기되었다. 예를 들자면 기능 획득이 되었을때 개화시기가 변화되는 CO 유전자 (17), TFL1 유전자 (18), 꽃 분열조직 정체성 결정 유전자인 LFY 유전자 (21) 등은 지금까지의 활성 표지 선별법에서 분리되지 않았다. 이 결과에 대해서는 여러가지 해석이 가능한데, 첫번째로는 아마도 활성 표지 선별법에서 T-DNA가 삽입되는 위치가 무작위적이지 않고 선택적으로 삽입되거나, 두번째로는 enhancer와 인근 유전자와의 상호작용을 막는 요인이 애기장대내에 존재하기 때문일 것이라는 것이다 (4). 세번째의 가설은 아마도 35S 프로모터와 enhancer의 전사 활성화기작은 서로 다르기 때문이라는 것이다. 이 세번째 가설은 적어도 2가지 서로 다른 유전자에서 실험적으로 입증되었기 때문에 현재로서는 이 가설이 더 설득력이 있다고 보여진다. 즉 동일한 유전자를 35S 프로모터와 35S enhancer에 발현이 조절받도록 하고 이들의 발현 양상을 조사한 결과, 서로의 발현 양상이 달랐다 (Figure 3). 개화시기에 관여하는 FT 유전자의 경우, 야생형 식물체에서 FT 유전자는 주로 지상부위에서만 발현되며 지하부위에서는 발현되지 않는다 (12). 35S 프로모터에 의해서 FT 유전자의 발현이 조절되도록 하면 FT 유전자가 모든 조직에서 발현되지만, enhancer에 의해 발현이 조절되면 지상부위에서만 발현이 나오는 것을 알 수 있었다. 바꿔 말하면 35S 프로모터는 FT 유전자를 진정한 전위 과량발현 (ectopic overexpression) 시키지만, 35S enhancer에 의한 FT 유전자의 활성화는 오로지 발현양에만 영향을 미치며 그외의 특성은 본래의 야생형 FT 프로모터의 성질을 따라가는 것으로 보인다. 이러한 또 하나의 예는 애기장대에서 BAS1 유전자에서도 보고 되었는데, 빛에의해 발현이 조절되는 BAS1은 35S enhancer에 의해 발현양이 증가함에도 불구하고 여전히 발현 패턴의 조절은 빛에 의해 조절되는 것이 보고되었다 (15). 이러한 증거들을 종합해보건데, 35S enhancer의 발현은 과량발현에는 기여하지만 조직특이적, 발달특이적 발현양상은 본래 프로모터의 특징을 따라가는 것으로 보인다. 결 론 기능 손실 돌연변이체를 통해서 유전자를 클로닝하고 그 기능을 연구하는 방법은 그 광범위한 활용성에도 불구하고 단점이 존재하여 그 유용성이 제한된다. 그리고 기능 손실 돌연변이체를 제조하는 것은 일반적으로 비교적 쉬운 반면, 해당 유전자를 클로닝하는 것은 매우 시간이 많이 소요되었다. 그러나 cauliflower 모자익 바이러스의 35S 프로모터 enhancer를 이용한 활성 표지 선별법 (activation tagging screen)은 기능 획득 돌연변이체를 선별함으로써 전술한 제한점을 극복할 수 있게 되었다. 특히 이 활성 표지 선별법은 얻어진 기능 획득 돌연변이체로부터 유전자를 분리하는데 걸리는 시간이 상대적으로 매우 짧다. 최근 형질 전환 기술의 발달로 대규모의 활성 표지 형질전환체 집단을 만드는 것이 점점 용이해지고 있기 때문에, 이 선별 방법과 유전학적 실험 방법을 병행하면 특정 신호전달체계의 하위 단계에 작용하는 유전자를 어렵지않게 분리할 수 있다. 따라서 선별법은 향후의 식물 분자유전학 연구에 유용성이 매우 높을 것으로 생각된다. 참고문헌 1. 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